Vulvovagi

Bối cảnh

Nhiễm trùng cổ tử cung dai dẳng do vi rút u nhú ở người (HPV) nguy cơ cao (HR) gây ra hầu như tất cả các bệnh ung thư cổ tử cung và các tổn thương tiền thân ngay lập tức của chúng [ 1 ]. Hầu hết phụ nữ có quan hệ tình dục đều đã từng bị nhiễm vi-rút HPV vào một thời điểm nào đó trong đời và đại đa số sẽ khỏi bệnh trong vòng vài tháng [ 2 ]. Tuy nhiên, một nhóm nhỏ phụ nữ bị nhiễm HPV dai dẳng khiến họ có nguy cơ cao bị tiền ung thư và ung thư cổ tử cung [ 2 – 5 ] Các yếu tố phi virus (đồng yếu tố HPV) liên quan đến kết quả của nhiễm trùng HR-HPV vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn. Trong khi hút thuốc [ 6 – 9 ], sử dụng biện pháp tránh thai nội tiết tố [ 10 , 11 ] và sinh con [ 12 ] có liên quan đến việc phát triển tiền ung thư và ung thư; các phản ứng miễn dịch toàn thân và tại chỗ được cho là quan trọng đối với việc thanh thải và kiểm soát nhiễm trùng (sự tồn tại so với thanh thải) [ 13 , 14 ]. Ngoài ra, các alen điều hòa miễn dịch của vật chủ cụ thể (ví dụ: kháng nguyên bạch cầu người) có liên quan đến nguy cơ ung thư cổ tử cung [ 15 , 16 ].
Hình 1. Lịch sử tự nhiên của HPV.
Môi trường vi mô cổ tử cung tại chỗ, bao gồm cả hệ vi sinh vật, cũng có thể ảnh hưởng đến lịch sử tự nhiên của nhiễm trùng HPV [ 17 ]. Các nghiên cứu khác gần đây đã chỉ ra vai trò của hệ vi sinh vật trong lịch sử tự nhiên của các bệnh nhiễm vi-rút khác [ 18 ] và nhiều loại ung thư [ 19 – 21 ]. Hệ vi sinh vật cổ tử cung và âm đạo (CVM) được đặc biệt quan tâm vì nó đã được mô tả rõ ràng và các đặc điểm cụ thể có liên quan đến bệnh phụ khoa và sức khỏe sinh sản [ 22 – 24 ]. CVM đã được phân loại thành các loại trạng thái cộng đồng (CST) thường được xác định bởi sự thống trị của một loài Lactobacillus cụ thể ( Lactobacillus crispatus ,Lactobacillus iners , Lactobacillus gasseri hoặc Lactobacillus jensenii ), hoặc tình trạng đa bào [ 25 , 26 ]. Việc chuyển đổi từ các CST do Lactobacillus chiếm ưu thế có liên quan đến các kết quả bất lợi về sức khỏe bao gồm tăng nguy cơ mắc các bệnh lây nhiễm qua đường tình dục [ 27 ], cũng như tỷ lệ sinh non cao hơn [ 28 ]. Mối liên quan giữa sự đa dạng CVM gia tăng và tỷ lệ nhiễm HR-HPV và/hoặc các bất thường ở cổ tử cung (so với âm tính với HPV) đã được báo cáo trong một số nghiên cứu [ 29 – 33 ]. Hàm lượng L cao hơn . crispatus đã được chứng minh là có liên quan đến tỷ lệ nhiễm HPV thấp hơn [ 34 ] và tăng khả năng phát hiện tế bào học bình thường [ 35 ]. Sử dụng lâu dài men vi sinh âm đạo với Lactobacillus spp. có liên quan đến việc tăng thanh thải HPV so với sử dụng ngắn hạn [ 36 ]. Tuy nhiên, bằng chứng còn mâu thuẫn về mối liên quan giữa tính đa dạng của CVM và mức độ nghiêm trọng của tân sinh cổ tử cung [ 37 – 39]. Ngoài ra, hầu hết các nghiên cứu xem xét lịch sử tự nhiên của HPV và hệ vi sinh vật đều là nghiên cứu cắt ngang và do đó thiếu khả năng rút ra các mối liên hệ nhân quả tiềm ẩn. Đối với nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã tận dụng dữ liệu theo chiều dọc và các mẫu bệnh phẩm từ nhánh giả dược của một thử nghiệm vắc-xin HPV ngẫu nhiên lớn [ 40 ] để kiểm tra tác động của CVM đối với lịch sử tự nhiên của các ca nhiễm HR-HPV nhằm nghiên cứu: 1) tiến triển đến cổ tử cung tiền ung thư, 2) sự tồn tại của virus và 3) sự thanh thải của virus.

Phương pháp

Nghiên cứu này được lồng ghép trong nhánh giả dược của Thử nghiệm vắc-xin HPV ở Costa Rica bao gồm phụ nữ từ 18–25 tuổi. Các mẫu cổ tử cung từ hai lần thăm khám của phụ nữ bị nhiễm HR-HPV (n = 273 phụ nữ) đã được sử dụng để đánh giá vai trò tiềm năng của CVM đối với lịch sử tự nhiên của HR-HPV. Chúng tôi tập trung đặc biệt vào việc loại bỏ nhiễm trùng, sự tồn tại và tiến triển thành tân sinh trong biểu mô cổ tử cung độ 2 và 3 (CIN2+). CVM được đặc trưng bởi sự khuếch đại và giải trình tự vùng gen 16S V4 rRNA của vi khuẩn và vùng ITS1 của nấm bằng cách sử dụng nền tảng Illumina MiSeq. Phân cụm OTU được thực hiện bằng QIIME2. Các nhóm chức năng được gán bằng PICRUSt và các phân tích thống kê được thực hiện bằng R.

Kết quả

Đặc điểm đối tượng và đặc điểm microbiome cổ tử cung

Tổng cộng có 273 phụ nữ bị nhiễm HR-HPV bất ngờ được đưa vào phân tích, trong đó 266 người có mẫu thứ hai với khoảng cách lấy mẫu trung bình là 1,5 ± 0,9 năm. Bảng 1 trình bày thông tin nhân khẩu học mẫu và tóm tắt kết quả giải trình tự vi khuẩn và nấm sau khi chỉ định phân loại cho từng kết quả lây nhiễm tại đường cơ sở. Không có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm về độ tuổi (p = 0,13), số lần đọc theo cụm OTU gen 16S rRNA (p = 0,33) hoặc số lần đọc theo cụm ITS1 OTU (p = 0,53).  
Bảng 1. Đặc điểm đoàn hệ CVT.
Phân tích các loại phân loại vi khuẩn của hệ vi sinh vật liên quan đến sự tồn tại/tiến triển so với độ thanh thải cho thấy có tổng cộng 24 đơn vị phân loại có ý nghĩa (LDA>2.0) ở phiên bản 1. G. _ vagis là loài vi khuẩn có mối tương quan tích cực cao nhất với sự tiến triển ( Hình 4A ) , trong khi L . iners là đơn vị phân loại có liên quan tích cực nhất với độ thanh thải dựa trên sự phong phú tương đối. Trong số các mẫu V2, có tổng cộng 13 đơn vị phân loại quan trọng được xác định (ba đơn vị phân loại liên quan đến giải phóng mặt bằng và 10 đơn vị phân loại có tiến triển) ( Hình 4B ). Ở V2, vi khuẩn thường liên quan đến viêm âm đạo do vi khuẩn, chẳng hạn như Prevotella amnii vàAnaerococcus prevotii , có tương quan đáng kể với sự tiến triển. Chúng tôi đã sử dụng mô hình tuyến tính tổng quát (GLM) để xác thực các dấu ấn sinh học LEfSe với các điều chỉnh cho các biến số chính (tuổi, tình trạng hút thuốc, HPV16 và truy cập CST) ( Bảng S1 ).
Hình 4. Vi khuẩn liên quan đến sự tiến triển thành CIN2+ được xác định bằng LEfSe.
Dấu ấn sinh học vi khuẩn HR-HPV cho lần khám 1 (bảng A) và lần khám 2 (bảng B), so sánh độ thanh thải với tiến triển, được xác định bằng công cụ LEfSe. Chỉ các phân loại vi khuẩn đáng kể (LDA>2.0) được hiển thị cho cả hai lượt truy cập.
  Phát hiện dấu ấn sinh học nấm cho thấy năm loài nấm có liên quan đến sự tiến triển của HPV ( S1A Fig .). Trung bình của năm phân loại nấm kết hợp được phát hiện ở tỷ lệ lần lượt là 0,59%, 3,55% và 3,76% đối với kết quả thanh thải, độ bền và tiến triển (p = 0,0080, Hình S1B ). Tuy nhiên, trong phân tích GLM đã điều chỉnh, không có dấu ấn sinh học nấm nào được xác định là có ý nghĩa ở cả hai lần thăm khám ( Bảng S2 ). Để đánh giá xem một số chức năng chung của vi khuẩn có thể liên quan đến kết quả HR-HPV hay không, chúng tôi đã sử dụng phân tích chức năng của các nhóm gen được xác định từ dữ liệu microbiome như được mô tả trong các phương pháp. Phân tích này cho thấy 8 lộ trình chức năng ở KEGG Cấp 2 có liên quan đáng kể đến quá trình chuyển sang CIN2+ ( Bảng S3 ). Trong số 8 con đường được xác định, chỉ có 2 con đường có độ bao phủ đọc trung bình >1% và được xem xét để phân tích thêm. Hai con đường được xác định là con đường “Phân hủy sinh học và Chuyển hóa Xenobiotics”, có liên quan tích cực đến sự tiến triển (p = 0,0020) và con đường Di động của tế bào, có liên quan tiêu cực đến sự tiến triển (p = 0,019). Hai con đường này có mối tương quan đáng kể (tương quan Pearson = -0,80, S2 Hình) và chúng tôi đã chọn sử dụng Tính di động của tế bào trong mô hình đa biến vì nó tạo ra ước tính GLM ổn định hơn ( Bảng S3 ).

Lịch sử tự nhiên của Microbiome và HR-HPV: mô hình GLM

Để điều tra sự đóng góp của các thành phần của hệ vi sinh vật theo thời gian, chúng tôi đã sử dụng GLM để điều chỉnh các biến số đã biết của tiến trình CIN2+ có thể ảnh hưởng đến mối quan hệ của CVM và tiến triển thành CIN2+ (ví dụ: tuổi, hút thuốc, HPV16 và CST). Chúng tôi đã sử dụng GLM với kết quả nhị phân (độ thanh thải/sự tiến triển) và các đặc điểm quan trọng của vi sinh vật được xác định trong các phần trước dưới dạng yếu tố dự báo. Cụ thể, chúng tôi đã sử dụng sự phong phú của Gardnerella ở V1, sự phong phú của Lactobacillus ở V1, sự đa dạng của các loài nấm được quan sát ở V1, con đường Chuyển động tế bào được tranh cãi ở V1 và sự đa dạng của vi sinh vật ở V2. Mô hình được điều chỉnh theo độ tuổi, CST, hút thuốc và tình trạng nhiễm HPV16. Hình 5hiển thị các ước tính mô hình của kết quả phân tích GLM. Phân tích đa biến cho thấy tác dụng bảo vệ đáng kể của sự phong phú của V1 Lactobacillus (chi), OR = 0,41 (0,22–0,79), sự đa dạng của các loài nấm V1, OR = 0,90 (0,82–1,00) và con đường di động của tế bào V1 được quy định OR = 0,75 (0,62– 0,92). Ngoài ra, mô hình cho thấy sự đa dạng của vi sinh vật V2 là một yếu tố rủi ro đáng kể đối với sự tiến triển của CIN2+, OR = 1,17 (1,02–1,29).  
Hình 5. Kết quả Mô hình tuyến tính tổng quát (GLM) cho thấy tỷ lệ chênh lệch của các thành phần vi sinh vật chính liên quan đến quá trình chuyển sang CIN2+. Biểu đồ rừng cho thấy kết quả của các biến được đánh giá trong phân tích đơn biến mà sau đó được nhập vào GLM. Mô hình hiển thị OR (vòng tròn nhỏ) và khoảng tin cậy 95% (đường kéo dài ở hai bên của vòng tròn) của các đặc điểm vi sinh vật liên quan đến khả năng thanh thải/sự tiến triển ở Lần khám 1 (V1) và/hoặc Lần khám 2 (V2). Các biến chính bao gồm V1 Gardnerella , V1 Lactobacillus , V1 OTU được quan sát bằng nấm và Tính di động của tế bào V1 và tính đa dạng của V2 Shannon. Mô hình được điều chỉnh theo độ tuổi, CST của vi khuẩn, tình trạng hút thuốc và nhiễm HPV16. 95% TCTD không vượt qua Tỷ lệ chênh lệch 1,0 (đường thẳng đứng chấm) được coi là có ý nghĩa thống kê.

Tóm tắt kết quả

Tại Lượt truy cập 1 (V1), sự phong phú của Lactobacillus iner có liên quan đến việc loại bỏ các trường hợp nhiễm HR-HPV mới (Phân tích phân biệt tuyến tính (LDA)>4.0), trong khi V1 Gardnerella là dấu ấn sinh học vượt trội cho sự tiến triển của HR-HPV (LDA>4.0). Ở lần truy cập 2 (V2), sự đa dạng Shannon của vi sinh vật tăng lên có liên quan đáng kể với sự tiến triển thành CIN2+ (p = 0,027). Phân tích hòa giải đa biến cho thấy mối liên hệ tích cực của Gardnerella V1 với tiến triển CIN2+ là do sự đa dạng của cổ tử cung và âm đạo tăng lên ở V2 (p = 0,040). Một mô hình đa biến đầy đủ các thành phần chính của CVM cho thấy tác dụng bảo vệ đáng kể thông qua chi V1 Lactobacillus, OR = 0,41 (0,22–0,79), đa dạng nấm V1, OR = 0,90 (0,82–1,00) và con đường Di động tế bào chức năng V1, OR = 0,75 (0,62–0,92), trong khi đa dạng vi khuẩn V2, OR = 1,19 (1,03–1,38 ) đã được chứng minh là có khả năng dự đoán sự tiến triển thành CIN2+.

Phần kết luận

Nghiên cứu này chứng minh rằng các đặc điểm của hệ vi sinh vật cổ tử cung và âm đạo có liên quan đến sự tiến triển của HR-HPV trong một đoàn hệ theo chiều dọc trong tương lai. Các phân tích chỉ ra rằng sự liên kết của Gardnerella và sự tiến triển thành CIN2+ thực sự có thể được trung gian bởi sự gia tăng đa dạng vi sinh vật sau đó. Các đặc điểm đã xác định của hệ vi sinh vật liên quan đến sự tiến triển của HR-HPV có thể là mục tiêu cho thao tác điều trị để ngăn ngừa CIN2+. Tài liệu tham khảo: https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1008376